Các chất trong chuối hột rừng

Y học dân gian Việt Nam từ lâu đã sử dụng nhiều bài thuốc cổ truyền hiệu quả từ các loài cây cỏ xung quanh, song bản chất hóa học của các nguồn dược liệu cũng như mối liên quan giữa cấu trúc hóa học và tác dụng dược lý chỉ mới được biết rất ít hoặc chưa biết. Do đó, việc nghiên cứu thành phần hóa học lý của các cây thuốc rất cần thiết và ý nghĩa trong lĩnh vực tổng hợp, điều chế thuốc . 

Tây Nguyên núi rừng nổi tiếng với những cây thuốc nam.

Trong đó, chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) được biết đến là loại thảo dược có chứa nhiều hoạt tính cao được dùng làm thuốc phổ biến từ lâu trong y học cổ truyền và kinh nghiệm dân gian. Các bộ phận của cây chuối hột rừng đều có tác dụng chữa bệnh tốt như bệnh táo bón, đau bụng, đau nhức xương, cao huyết áp, tiểu đường. Bên cạnh đó, đồng bào địa phương khi đi rừng khát nước thường chặt cây chuối rừng, dùng lõi ăn sống hoặc ép lấy nước uống. Người đi rừng thành thạo luôn tìm tới đóng trại ở những thung lũng có cây chuối rừng, đó là nơi có nguồn nước tinh khiết và nhiều nhất trong mùa hè.

Với nhiều công dụng như trên, chuối hột rừng đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và sử dụng dưới cả dạng tươi hoặc khô. Một số nghiên cứu trên thế giới đã tìm ra nhiều chất trong quả chuối hột rừng có tính ứng dụng cao trong cuộc sống, nhưng các nghiên cứu về thành phần hóa học có trong chuối hột rừng vẫn còn rất ít. 

Ở Việt Nam các kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của quả chuối hột đã được công bố, tuy nhiên nghiên cứu về thành phần hóa học của chuối hột rừng thì còn hạn chế, chủ yếu là các nghiên cứu về tác dụng dược lý của chuối hột rừng dựa vào kinh nghiệm dân gian.  

Vì vậy, tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học trong một số dịch chiết của chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) ở Tây Nguyên” nhằm đóng góp thông tin khoa học về thành phần hóa học của loài cây này.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Qủa chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) được thu hái tại Tây Nguyên - Việt Nam.

MỤC TIÊU VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

• Xác định một số thông số hóa lý của chuối hột rừng.
• Xác định thành phần hóa học, công thức cấu tạo của một số hợp chất có trong quả chuối hột rừng.
• Phân lập một số chất có trong quả chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla) ở Tây Nguyên.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu lý thuyết

• Thu thập, tổng hợp, phân tích các tư liệu trong và ngoài nước về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hóa học, tác dụng dược lý của chuối hột rừng.
• Tổng hợp tài liệu về phương pháp nghiên cứu chiết tách và xác định các hợp chất thiên nhiên.

Nghiên cứu thực nghiệm

• Phương pháp lấy mẫu, thu hái và xử lý mẫu.
• Phương pháp phân tích trọng lượng để xác định các thông số hóa lý (xác định độ ẩm trong nguyên liệu tươi).
• Phương pháp phân hủy mẫu phân tích để khảo sát hàm lượng tro.
• Phương pháp chiết: chiết soxhlet trong dung môi n-hexane, ethyl acetate (EtOAc), dichloromethane.
• Phương pháp vật lý: phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) để xác định hàm lượng các kim loại nặng; phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối (GC-MS) nhằm xác định thành phần, định danh các cấu tử trong mỗi dịch chiết.
• Phân lập một số chất trong chuối hột rừng bằng phương pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, các phương pháp kết tinh phân đoạn.
• Các phương pháp xác định cấu trúc một số chất: kết hợp các phương pháp đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR): ¹H-NMR, ¹³C-NMR, cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D NMR): HMQC, HMBC và các phương pháp khác để xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được.

BỐ CỤC CỦA LUẬN VĂN:

Luận văn bao gồm  trang,  bảng,  hình, ảnh,  tài liệu tham khảo và  phụ lục. Với:  

Phần mở đầu 

Chương 1 – TỔNG QUAN 

Chương 2 – CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 

Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  

Tài liệu tham khảo 

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1. SƠ LƯỢC VỀ CHI MUSA- HỌ CHUỐI (MUSACEAE)

1.1.1. Vài nét về họ chuối

1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố của chuối hột rừng

1.1.3. Giới thiệu một số đặc điểm của cây sống đời

1.1.4. Ứng dụng trong y học ở Việt Nam và thế giới

1.1.5. Nghiên cứu hoá học về chi Musa

1.2. CƠ SỞ LÍ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP CHIẾT 

1.3. CƠ SỞ LÍ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ HẤP THỤ NGUYÊN TỬ (AAS)

1.4. CƠ SỞ LÍ THUYẾT VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ

GHÉP KHỐI PHỔ (GC-MS)

1.5. KỸ THUẬT SẮC KÝ BẢN MỎNG

1.6. SẮC KÝ CỘT

1.7. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HOÁ HỌC

CỦA MỘT HỢP CHẤT

1.8. PHƯƠNG PHÁP THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

CHƯƠNG 2 CÁC NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM

2.1.  NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT

2.1.1.Nguyên liệu

Nguyên liệu nghiên cứu là quả chuối hột rừng, được thu hái tại Tây Nguyên vào tháng 3 năm 2015. Quả chuối hột rừng sau khi được thu hái sẽ được rửa sạch, phơi, sấy khô và xay nhỏ thành bột để sử dụng cho phần nghiên cứu.

            2.1.2. Hoá chất

  2.1.3. Thiết bị thí nghiệm

2.2. SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

Hình 2.1. Sơ đồ điều chế các cao chiết

2.3. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ HÓA LÍ

2.3.1. Xác định độ ẩm

2.3.2. Xác định hàm lượng tro

2.3.3. Xác định hàm lượng kim loại

2.4. XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC TRONG CÁC

DỊCH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS

2.5. PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHẤT CÓ TRONG CAO ETHYL ACETATE CỦA CHUỐI HỘT RỪNG 

2.5.1. Tạo các cao chiết

2.5.2. Tiến hành chạy sắc ký bản mỏng

2.5.3. Tiến hành sắc ký cột

2.5.4. Chạy cột sắc ký phân đoạn CHRE6

2.6. THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN 

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1.  XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÝ

 3.1.1  Độ ẩm

        Độ ẩm trung bình của quả chuối hột rừng là 13.711%.

 3.1.2. Hàm lượng tro 

       Hàm lượng tro trung bình là 5.276%.

 3.1.3. Xác định hàm lượng một số kim loại 

       Hàm lượng kim loại trong chuối hột rừng không gây ảnh hưởng đến sức khoẻ con người.

 3.2. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

 Cao chiết phân đoạn ethyl acetate chuối hột rừng có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định,với cao chiết phân đoạn nhexane không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định.

3.3. HIỆU SUẤT CHIẾT

 Dung môi methanol cho hiệu suất chiết cao nhất. Đây là một trong những cơ sở để lựa chọn dung môi methanol là dung môi chiết cao tổng trong phương pháp chiết lỏng-lỏng để tiến hành phân lập.

3.4. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU BẰNG PHƯƠNG PHÁP GC-MS

3.4.1. Dịch chiết n-hexane bằng phương pháp chiết soxhlet

Bằng phương pháp GC, kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexane của chuối hột rừng cho thấy: trong dịch chiết nhexane có 7 cấu tử  được định danh, trong đó chủ yếu là: nhexadecanoic acid, Beta.–Sitosterol, Cis-13-octadecenoic acid. Các cấu tử còn lại có hàm lượng thấp và các hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh.

3.4.2. Dịch chiết dichloromethane bằng phương pháp chiết soxhlet

Bằng phương pháp GC, kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết dichloromethane của chuối hột rừng cho thấy: trong dịch chiết dichloromethane có 13 cấu tử được định danh, trong đó chủ yếu là: n-hexadecanoic acid, 9,12-Octadecadienoic acid (Z,Z)-, Beta.Sitosterol, Cis-13-Octadecenoic acid. Các cấu tử còn lại có hàm lượng thấp và các hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh.

3.4.3. Dịch chiết ethyl acetate bằng phương pháp chiết soxhlet

Bằng phương pháp GC, kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate của chuối hột rừng cho thấy: trong dịch chiết ethyl acetate có 7 cấu tử được định danh, trong đó chủ yếu là: nHexadecanoic acid, Beta.-Sitosterol, Phenol, 2-propyl-, Cis-13Octadecenoic acid. Các cấu tử còn lại có hàm lượng thấp và các hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh.

 3.4.4. Dịch chiết methanol  bằng phương pháp chiết soxhlet

Bằng phương pháp GC kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết methanol của chuối hột rừng cho thấy: trong dịch chiết methanol có 9 cấu tử được định danh, trong đó chủ yếu là: 2Furancarboxaldehyde, 5-(hydroxymethyl)-, 4H-Pyran-4-one, 2,3dihydro-3,5-dihydroxyl-6-methyl-. Các cấu tử còn lại có hàm lượng thấp và các hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh.

3.4.5. Dịch chiết n-hexane bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

Bằng phương pháp GC, kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết n-hexane của chuối hột rừng cho thấy: trong dịch chiết nhexane có 17 cấu tử được định danh, trong đó chủ yếu là: 9,12Octadecadienoic acid (z,z), Beta. –Sitosterol, n-Hexadecanoic acid, 11-Octadecenoic acid Methyl ester. Các cấu tử còn lại có hàm lượng thấp và các hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh.

3.4.6. Dịch chiết ethyl acetate bằng phương pháp chiết lỏnglỏng

Bằng phương pháp GC kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết ethyl acetate của chuối hột rừng cho thấy: trong dịch chiết ethyl acetate có 18 cấu tử được định danh, trong đó chủ yếu là: Phenol, 3-ethyl-, 2-Furancarboxaldehyde, 5-(hydroxymethyl)-, 4HPyran-4-one, 2,3-dihydro-3,5-dihydroxyl-6-methyl. Các cấu tử còn lại có hàm lượng thấp và các hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh.

3.4.7. Dịch chiết methanol bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng

Bằng phương pháp GC kết quả xác định thành phần hóa học dịch chiết methanol của chuối hột rừng cho thấy: trong dịch chiết methanol có 5 cấu tử được định danh, trong đó chủ yếu là: 2Furancarboxaldehyde, 5-(hydroxymethyl)-, 4H-Pyran-4-one, 2,3dihydro-3,5,dihydroxy-6-methyl. Các cấu tử còn lại có hàm lượng thấp và các hợp chất khác tạm thời chưa thể định danh.   

3.5. KẾT QUẢ PHÂN LẬP CAO ETHYL ACETATE

3.5.1. Số liệu phổ và cấu trúc của chất E1

Số liệu trên phổ ^[1]H- NMR và phổ ¹H- NMR giãn của chất E1 cho thấy có 14 proton trong phân tử chất. Số liệu phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 16 cacbon. Các đặc trưng vạch phổ và tương quan số nguyên tử C và H trong phân tử E1 cho phép dự đoán E1 là một chất thuộc khung flavan.  

Ø Phổ ¹H-NMR (MeOH, 500MHz)

Phổ ¹H-NMR của chất này cho thấy tín hiệu cụm các tín hiệu

4 proton nhân thơm của nhóm -CH với 2 cặp proton tương đương, có độ chuyển dịch hóa học ở 6.729 ppm (2H, d, J = 8.36 Hz) và 7.239 ppm (2H, d, J= 8.36 Hz)  gợi ý vòng thơm bị thế hai lần ở vị trí para. Một nhóm -CH2 với hai tín hiệu multiplet của 2 proton lần lượt ở δ =  2.50 và 2.71 ppm.  Ngoài ra, tín hiệu δ=5.734 và 5.904 ppm là 2 proton của của vòng thơm cho thấy các vị trí 7 và 5 đã bị thế.

Ø Phổ ¹³ C-NMR (CDCl₃, 125 MHz)

Phổ ¹³C-NMR của chất E1 cho thấy 14 tín hiệu carbon, trong đó 1 tín hiệu nhóm –CH₂ đặc trưng ở δ = 28.2ppm ở phía trường cao, 4 tín hiệu của nhóm –CH nhân thơm (vòng C), với các độ chuyển dịch hóa học là δ=114ppm (C5’, C3’) và δ = 128 ppm (C6’, C2’) tương ứng với 4 proton nói trên. Các tín hiệu trong khoảng độ chuyển dịch từ  98.4 đến 130 ppm cho thấy các tín hiệu của nhóm –CH của vòng thơm.

Hình 3.2. Phổ ¹³C-NMR (DMSO) của chất E1

            Các số liệu phổ của chất E1 hoàn toàn tương ứng với phổ của chất 2-(4-hydroxyphenyl) chroman-3,5,7-triol) được phân lập từ loài Cycas beddomei.

            Vị trí nhóm –CH₂ ở vị trí C4 được khẳng định bằng các tương tác qua một liên kết giữa C4 với 2 proton H4 (1-2) trên phổ HSQC.

       Hình 3.3. Phổ HSQC-1 (DMSO) của chất E1

             Tương tự, vị trí của các proton nhóm –CH của các vòng A và

B ở các vị trí 3, 2, 8 và 6 thể hiện qua các tương tác trực tiếp C-H trên phổ HSQC.

Hình 3.4. Phổ HSQC-2 (DMSO) của chất E1

Vị trí của 3 nhóm –OH được khẳng định nhờ các tương tác trên phổ HMBC của H4(1) với C9, C10 và C3; tương tác của H2 với

C9, C1’, C6’ và C2’; tương tác của H6 với C10, C8 và C7; tương tác của H8 với C10, C7 và C6.

             Từ việc phân tích các dữ liệu phổ của chất E1 và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép khẳng định chất E1 là 2-(4-

hydroxyphenyl) chroman-3,5,7-triol. Chất này được xác định có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt.

Công thức cấu tạo của E1 là:

3.5.2. Số liệu phổ và cấu trúc của chất E2

Số liệu trên phổ ¹H- NMR và phổ ¹H- NMR giãn rộng chất E2 cho thấy có 10 proton trong phân tử chất. Số liệu phổ 13C-NMR cho thấy tín hiệu của 5 cacbon. Các đặc trưng vạch phổ và tương quan số nguyên tử C và H trong phân tử E2 cho phép dự đoán E2 là một hợp chất no, không có vòng. 

Ø Phổ ¹H-NMR (MeOH, 500MHz)

Phổ ¹H-NMR của chất này cho thấy tín hiệu cụm các tín hiệu 10 proton với 1 nhóm CH₃ đặc trưng ở δ = 2,01 ppm (3H). 

Ø Phổ ¹³ C-NMR (CDCl₃, 125 MHz) 

Phổ ¹³C-NMR của chất E2 cho thấy 5 tín hiệu carbon, trong đó 1 tín hiệu nhóm –CH₃ đặc trưng ở δ =20,79 ppm ở phía trường cao phù hợp với tín hiệu của 3 proton trên phổ ¹H-NMR, tín hiệu carbon bậc 4 của nhóm –C=O carboxyl chuyển dịch về phía trường thấp ở δ=170,54 ppm.

Các số liệu phổ của chất E2 hoàn toàn tương ứng với phổ của chất 2,3-dihydroxypropyl acetate được công bố trong thư viện dữ liệu phổ hợp chất thiên nhiên.

Vị trí các nhóm nguyên tử –CH, –CH₂ và –CH₃ được khẳng định nhờ các tương tác trực tiếp H-C trên phổ HSQC. Tương tác của H3 với C3; tương tác của 2 proton H1 với C1; tương tác của H2 với C2 và tương tác của 3 proton H1” với C1”.

Hình 3.7. Phổ HSQC (DMSO) của chất E2

Vị trí các nhóm chức được khẳng định nhờ các tương tác qua nhiều liên kết giữa H-C trên phổ HMBC. Tương tác của C1’ với proton  H1” và 2 proton  H1; tương tác của H2’ với các carbon C2, C1 và C3; tương tác của H3’ với C3; tương tác của 2 proton  H1 với C2 và C3; tương tác của H3 với C2 và C1.

Hình 3.8. Phổ HMBC (DMSO) của chất E2

Từ việc phân tích các dữ liệu phổ của chất E2 và so sánh với tài liệu tham khảo cho phép khẳng định chất E2 là 2,3-dihydroxypropyl acetate.

Công thức cấu tạo của E2 là:

3.5.3. Các chất E3 và E4

Dựa vào số liệu phổ ¹H và ¹³C-NMR, màu sắc và hình dạng vệt sắc ký bản mỏng, có thể khẳng định các chất E3 và E4 là các chất sạch. Để xác định chính xác cấu trúc của hai chất này cần bổ sung thêm nhiều số liệu khác như phổ IR, MS, NMR 2 chiều, tuy nhiên vì điều kiện trang thiết bị và thời gian thực nghiệm có hạn nên chưa đủ thông tin để xác định được cấu trúc của các chất này.

a. Số liệu phổ chất E3

b. Số liệu phổ chất E4

Dựa vào số liệu phổ, hình ảnh sắc ký bản mỏng, có thể khẳng định đây là chất sạch.Tuy nhiên, vì thời gian thực nghiệm có hạn nên chưa xác định được cấu trúc của chất này.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận   

2. Đã xác định một số chỉ tiêu hóa lí của chuối hột rừng:

• Độ ẩm: 13.711%.
• Hàm lượng tro: 5.276%.
• Hàm lượng kim loại Cu, Zn, Pb, Cd, Hg, As trong chuối hột rừng không gây ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
  2. Hoạt tính sinh học

Cao chiết phân đoạn ethyl acetate chuối hột rừng có hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định,với cao chiết phân đoạn nhexane không thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với vi khuẩn kiểm định.

3. Bằng phương pháp GC-MS đã định danh được 40 cấu tử.

Trong đó, bằng phương pháp chiết soxhlet, định danh được 7 cấu tử trong dịch chiết n-hexane, 13 cấu tử  trong dịch chiết dichloromethane, 7 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate, 9 cấu tử trong dịch chiết methanol. Bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng, định danh được 17 cấu tử trong dịch chiết n-hexane, 18 cấu tử trong dịch chiết ethyl acetate, 5 cấu tử trong dịch chiết methanol.

4. Bốn hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc từ cao chiết ethyl acetate chuối hột rừng (Musa Acuminata Colla): - Chất E1: 2-(4-hydroxyphenyl) chroman-3,5,7-triol. Chất này được xác định có hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm tốt.

• Chất E2: 2,3-dihydroxypropyl acetate.
• Các chất E3 và E4: đã được xác định là chất sạch, có số liệu đo các phổ ¹H và ¹³C-NMR.

1. Kiến nghị

 Do thời gian nghiên cứu có hạn, thông qua kết quả của đề tài chúng tôi mong muốn đề tài được phát triển rộng hơn về một số vấn đề như sau:

1. Nghiên cứu sâu hơn thành phần các dịch chiết của chuối hột rừng, phân lập và xác định các hợp chất hóa học chưa định danh trong chuối hột rừng.
2. Tiếp tục thử các hoạt tính sinh học các dịch chiết dichloromethane, MeOH của chuối hột rừng và nghiên cứu các bộ phận khác của chuối hột rừng như: thân, lá.
3. Các kết quả nghiên cứu trên đây là cơ sở để có thể tạo ra một chế phẩm có hoạt tính độc tế bào, góp phần vào việc điều trị ung thư từ cao chiết EtOAc chuối hột rừng, một loài cây được trồng rất phổ biến ở Tây Nguyên.